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第8章 微生华彩彩票物菌种的筛选及鉴定

作者:admin 发布时间:2019-07-27 06:04

  第8章 食物微生物菌种的筛选及判断 主 讲 惠 明 博士 本节重心 ? 食物工业上规范的微生物菌种 ? 微生物菌种的涣散筛选及判断 ? 微生物菌种的发酵要求优化 一、规范工业微生物菌种 细菌:枯草杆菌,短杆菌,大肠杆菌 酵母:酿酒酵母(啤酒,葡萄酒),酒精酵 母,假丝酵母 霉菌:黑曲霉,土曲霉,米曲霉,红曲霉, 根霉,木霉,青霉 放线菌:单孢菌 其他:藻类 发酵工业常睹常用的细菌 Leuconostoc mesenteroides Pediococcus cerevisiae Bacillus subtilis Acetobacter aceti Lactobacillus delbrukii Steptococcus lactis Clostridium acetobutylcum Corynebacterum pekinese Brevibacterium ammoniagenes 肠膜明串珠菌 啤酒足细菌 枯草芽孢杆菌 醋化醋杆菌 德氏乳杆菌 乳链球菌 丙酮丁醇梭菌 北京棒杆菌 产氨短杆菌 常睹工业微生物及其产品 ? 细菌 短杆菌:谷氨酸、肌苷酸 枯草芽孢杆菌:淀粉酶、卵白酶、核糖 大肠杆菌:酰胺酶 节杆菌:强的松 梭状杆菌:丙酮、丁醇 工业上常用的放线菌及产品 ? 链霉菌属 Streptomyces 坐褥抗生素、维生素、酶及酶强迫剂 ? 诺卡氏菌属 Nocardia 坐褥抗生素,石油脱蜡、烃类发酵, 管理含氰废水 ? 小单孢菌属 Micromonospora 庆大霉素,Rifamycin ? 孢囊链霉菌属 Streptosporanium 众霉素 放线 常睹工业微生物及其产品 ? 酵母 酒精酵母:乙醇 甘油酵母:甘油 假丝酵母:环烷酸、SCP 啤酒酵母:细胞色素、辅酶、酵母片 类酵母:脂肪酶 阿氏假囊酵母:核黄素 脆壁酵母:乳糖酶 常睹工业微生物及其产品 ? 霉菌 黑曲霉:柠檬酸、卵白酶、单宁酶、 糖化酶 栖土曲霉:卵白酶 根霉:糖化酶、甾体激素、 青霉:青霉素、葡萄糖氧化酶 木霉:纤维素酶 红曲霉:糖化霉、红曲色素 霉菌分生孢子 Saccharomyces cerevisiae Bacillus subtilis B53 NATTO BEER 二、食物工业微生物菌种的起源 ? ? ? 工业上对坐褥菌种的根本央求 从自然界平分离方针菌种的规定 菌种选育的大凡要领 2.1 对工业微生物菌种的根本央求 ? 可能运用便宜的原料,单纯的培植基,多量高效地 合成产品 ? 相闭合成产品的途径尽或者地单纯,或者说菌种改 制可操作性要强 ? 遗传机能要相对宁静 ? 不易感化杂菌或噬菌体 ? 出现菌及其产品的毒性务必酌量(正在分类学上最好 与致病菌无闭) ? 坐褥特征要适合工艺央求 11 2.2 从自然界平分离筛选菌种 坐褥菌株起源 1、索取或购置 2、本人选育 ? 用原有菌株举办遗传改制举办育种 诱变育种/基因重组育种 ? 向菌种保藏机构索取、购置动身菌株举办选育 ? 从自然界平分离菌种 从自然界平分离菌种即是从自然界微生物资源 中有方针、神速、确切地选出所须要的菌种。 从自然界平分离筛选菌种的大凡方法 安排计划→采样→增殖培植*→平板分 离 →筛选(初筛、复筛)→单株纯种涣散 →机能视察(坐褥机能试验、毒性试验、 菌种判断) 2.2.1采样 从自然界种搜集含方针菌的样品 1. 情况要求对土样本中微生物分散的影响 (1)养分情况 ①高糖情况(加工蜜饯、糖果、蜂蜜的情况)土 壤中:耐渗出压酵母,柠檬酸出现菌,氨基酸出现 菌; ②富含淀粉情况污泥、水沟旁泥土中:淀粉酶产 生菌; ③丛林中腐叶烂草下泥土:纤维素酶出现菌; ④含卵白质(蚕丝、豆饼、生皮晒厂)泥土中: 卵白酶出现菌; ⑤油田土:石油阐明菌 ; (2)水分 ①取离地外5-15cm的土样 ②含水过众、过少都不睬念 (3)温度:采样以秋季为好 (4)透风 (5)酸碱度: 细菌、放线菌:中性或偏碱; 霉菌、酵母:偏酸 2. 采样要领 (1)去除外层土 (2)取 5-15cm 土样几十克,装入无菌牛皮低袋 或逆料袋中 3. 戒备 ? 记载:年华,住址,情况状况等 ? 样品袋应封好口,防卫水分落空 ? 土样应正在涣散前决裂 ? 尽速涣散 2.2.2增殖培植(富集培植) ? ? ? 合用:样品中方针菌数目不足众时 方针:升高样品中方针菌的数目和比例 道理:通过管制养分因素或培植要求,华彩彩票使方针菌得以 生息和/或非方针菌的成长受到强迫 1、 要领 (1)管制养分因素 ① 纤维素为独一碳源,可增殖阐明纤维素的菌 ②可溶性淀粉为独一碳源,可增殖产淀粉酶的菌种 ③酒精废水,能够增殖废水运用菌 * 众种微生物所运用的碳源、氮源不行作管制身分 (2)管制培植基pH 细菌、放线菌:中性偏碱,真菌:偏酸 但非方针菌的成长不行被全部强迫 (3)管制培植温度 ? 30℃控制培植,可培殖嗜温微生物 ? 50~60 ℃培植,可培殖嗜热微生物, 筛选耐热菌株 (4)热管理——增殖芽孢细菌 样品悬浮液经 80 ℃、 10min管理,杀 死养分体,再增添养分培植后可增殖产芽 孢细菌 (5)增添强迫剂 ? 10%苯酚数滴:强迫细菌、霉菌成长,增殖放 线菌 ? 众粘菌素B:强迫G-细菌 ? 青霉素:强迫G+细菌 ? 制霉菌素:强迫真菌 ? 放线菌酮:强迫真菌 实例:碱性纤维素酶出现菌的筛选 文献:出现菌为中性芽孢杆菌,嗜碱芽孢杆菌、放线% CMC(羧甲基纤维素),pH10.5 培植3~4d,挑选有凹陷圈的菌落 采样(制纸厂) 26株为构成型 从285个土样中得回62株 36株为诱导型 21 2.2.3纯种涣散 ? 方针:将方针菌从杂沓的微生物平分离出来,得回 纯培植 1 纯种涣散的大凡要领 ? 稀释平板法 倾注平板或涂布平板 ? 划线法 稀 释 分 离 涂 布 平 板 稀 释 分 离 倾 注 平 板 划线)结构培植法 合用于涣散上等真菌及植物病原菌 上等线%漂白粉消毒管理→无菌水冲洗 →置琼脂平板上→培植→长出菌丝体 戒备:对扩张性霉菌: ① 加1%去氧胆酸钠 ② 察氏培植基:0.01%蔗糖, 0.1%山梨糖 2、平皿响应神速检出法——定性或半定量 (1)纸片培植显色法 ? 滤纸饱浸含有指示剂的液体培植基 ? 用接种环接种 ? 保湿恒温培植 ? 据菌落边际变色圈和菌落直径比值判别方针物产量 (2)透后圈法 按照琼脂培植上透后圈 /菌落直径巨细判别方针产 物的产量 ? 淀粉平板透后圈:淀粉酶 ? 碳酸钙平板透后圈:产酸 ? 酪素(卵白)透后圈:卵白酶 以大肠杆菌E. coli ATCC 80739为指示菌, 对枯草芽孢杆菌R21-4举办紫外诱变,筛选 取得一株具有优越遗传宁静性的枯草芽孢杆 菌R21-15,抗菌卵白的效价升高58.49%。 粗提卵白对棉花黄、凋落病菌的强迫影响 (3)变色圈法 ? 淀粉平板喷稀碘液:透后圈,液化型淀粉酶 ? 支链淀粉平板喷稀碘液: 蓝色圈:异淀粉酶 无色圈:液化型淀粉酶 ? 葡聚糖平板加刚果红:葡聚糖酶 ? 木聚糖平板加刚果红:木聚糖酶 (4)成长圈法 ? 用具菌: ? 养分缺陷型,不行合成的物质(成长身分)为方针 菌积攒的产品 ? 菌落状态鲜明区别于方针菌 ? 要领: 106~107 用具菌与样品稀释液一同涂布至 琼脂培植基外面,具有成长圈的菌落即为方针菌 ? 合用:氨基酸,核苷酸,维生素出现菌的选育 (5)强迫圈 ? 合用:抗生素出现菌的选育 用具菌:对方针抗生素敏锐的微生物 例:方针菌为出现抗G+细菌的抗生素的菌株 ? 用具菌可运用金黄色葡萄球菌 ? 要领 ? 方针菌涣散:稀释涣散法,培植长出菌落 ? 代谢物积攒:用打孔器( 6MM)将菌落连同边际琼脂 培植基一同取下,放一无菌空培植皿内,保湿培植 45d,使新出现抗生素积攒于小琼脂块中 ? 测定:取107用具菌涂布于琼脂培植基,将小琼脂块放 于上面培植住宿,抑菌圈的显现,评释琼脂块中有抗 生素,巨细评释抗生素单元的坎坷 琼 脂 块 培 养 法 筛 选 抗 生 素 产 生 菌 程 序 (6)菌落特质 ? 从状态的角度 菌落的外观状态,是微生物 的一个紧张外征。如众糖出现 菌正在适宜的培植基上成长 ,从 具有粘液性的菌落外观上就可 以发端识别。 (7)从产品角度动身 ? 正在培植时以产品的酿成有方针的安排培植基 ? 运用单纯、神速的判断要领,如抗生素 ? 产品分子的布局定性阐发(运用紫外扫描光谱、 核磁共振、CD谱、高压液相色谱、远红外阐发、 X-射线衍射阐发、穆斯堡尔谱等) ? 产品的定量阐发 35 3、厌氧性微生物的涣散法 ( 1 )去除培植基中的融化氧,低落 Eh(氧化 还原电位) ? 煮沸法:将培植基置开水中煮沸15分钟,驱 除 其 中 的 溶 解 氧 , 勿 再 摇 动 , Eh 可 降 至 0.1V 以下 ? 培植基预还原:将培植基中插手还原性物质: 半胱氨酸,巯基化生物,Na2S,抗坏血酸等 低落Eh (2)成立无氧情况 物理除氧 ? 氛围置换法:干燥器或厌氧培植罐 抽线% +H2 10% + N2 80% 化学除氧 ? H2 + O2 → H2O (钯作催化剂) ? GASPAK罐除氧:硼氢化钠、柠檬酸,碳酸氢钠化 学响应出现H2 和CO2,H2与O2响应天生水 ? 厌氧指示剂 (3)厌氧涣散(培植)技能 ? 高层琼脂柱技能 ? 厌氧罐技能 ? 厌氧手套箱技能 厌氧手套箱 厌氧培植装配 2.2.4 筛选 1 、初筛:透风发酵菌种,通过摇瓶发酵举办, 每株一瓶 ? 方针:减少80%-90%的涣散菌株中的低产菌 ( 1 )培植要求:首要通过查阅材料及须要而预 先断定:如培植基构成,透风量(装液量,摇 瓶机转数),pH、温度、培植年华等。 ( 2 )阐发测定:最好定量,如较穷困时可选取 半定量要领 2、复筛:每株3~5瓶,可提前培植种子,使 接种量对照一律,3~5%接种量, ? 培植要求可同初筛 ? 阐发测定:定量,戒备副产品 复筛可举办众次,逐渐减少,留下3~5株 以至最好的1株 初筛和复筛的对照 初 种 摇 接 种 子 瓶 量 筛 复 筛 斜 面 菌 种 每 株 1 瓶 每 瓶 一 环 留 下 产 量 较 高 的 10- 20% 的 菌 株 液 体 种 子 每 株 3 -5 瓶 3— 5% 每 次 保 留 10— 20% , 直 至 最 后 3— 5 株 取 舍 情 况 好氧培植 2.2.5 复筛高产菌株的分类判断 ? 菌体状态特质阐发 菌体巨细、布列、运动性、产芽孢(孢子)特质、 产荚膜?鞭毛、菌丝分枝?染色特质 ? 心理生化特质阐发 碳源、氮源、无机盐、成长因子、产酶响应、药物 敏锐性 ? 遗传特质判断 1、G+C(mol%)(不同5%能够以为区别种, 10%能够以为区别属, 2、 16s rRNA的基因序列(同源性97%以为同种) 45 举例:产PGA芽孢杆菌的判断 ? 细胞状态特质 菌体巨细 芽孢形式 芽孢着生处所 G+或G-等 46 心理生化特质 47 2.2.6 培植工艺要求试验与坐褥试验 1、摇瓶发酵要求 培植基构成,初始pH,透风量(装液量), 接种量,培植温度… 2、小型台式发酵罐发酵工艺要求 融化氧管制,pH值管制,原料增添形式, 消泡剂… 50 培植基配方的得回 ? ? ? ? ? 独身分试验 众身分试验(正交试验) 回归试验 最佳配方的验证 全豹发酵要求的优化 51 举例 碳氮源对Bacillus subtilis发酵产PGA的影响 ? 基 本 发 酵 培 养 基 : L-Glu 20g/L,CTA 10g/L, NH4Cl 4g/L,MgSO4?7H2O 0.5g/L,FeCl3?6H2O 0.02g/L,K2HPO4 1g/L,CaCl2?2H2O 0.2g/L, MnSO4?H2O 0.05g/L, 蒸馏水配制,用 NaOH 调 pH7.4, 0.1MPa灭菌20min。 ? 根本发酵要求:采用300mL三角瓶,装液量50mL,无 菌培植容器封口膜封口,摇瓶转速150rpm,种子液 种龄24h,接种量4%,37℃振荡培植96h。 ? 发端确定或者的培植基因素(以碳源为例) 枯草芽孢杆菌合成γ -PGA培植基 优化的回归试验安排 ? 对甘油及柠檬酸增添量的优化(正交组合安排) 挑选身分:Z1——甘油(g/L),40~120; Z2——柠檬酸(g/L),4~20 其 它 发 酵 条 件 为 : Glu 20g/L,(NH4)2SO4 7g/L, K2HPO4????3H2O 0.7g/L,MgSO4??7H2O 0.5g/L, FeCl3?6H2O 0.02g/L,CaCl2 0.25g/L,MnSO4?H2O 0.3g/L,pH6.5,装液量 50mL/300mL 三角瓶,接种量 4%(培植24h种子液),摇瓶转速150r/min。 取三秤谌, Z1:40,80,120; Z2:4,12,20。作变换: X1=(Z1-80)/40, X2=(Z2-12)/8 ? 试验计划及试验结果的阐发下外 ? 归纳对碳源、氮源及无机离子的优化试验,得 到优化发酵培植基(二): ? L-Glu 20g/L,CTA 9.864g/L,Glycerol 80.36g/L, (NH4)2SO4 7g/L,MgSO4?7H2O 0.5g/L, FeCl3?6H2O 0.0224g/L,K2HPO4 0.8922g/L, CaCl2 0.0323g/L, MnSO4?H2O 0.3g/L, 蒸馏水 设备,用NaOH调pH6.5,0.1MPa灭菌20min。 ? 根本发酵要求:采用300mL三角瓶装液量50mL, 种 子 液 2 4 h, 接 种 量 4 % ( v/v), 摇 瓶 转 速 150r/min,37℃振荡培植96h。 摇瓶秤谌到响应器秤谌的优化配方 摇瓶、响应器培植基讨论的两个主意 ? 摇瓶——培植基安排的第一步 ? 响应器—最终的优化的根基配方 例:青霉素发酵 发酵摇瓶:玉米浆4%,乳糖10%,(NH4)SO4 0.8% 轻质碳酸钙1% 发酵罐:葡萄糖流加管制总量10-15%,玉米浆总量4-8% 补加硫酸、前体等 摇瓶发酵培植基和罐的根基培植基差异很大 pH管制摇床:响应器秤谌上的摇瓶讨论 发酵罐:响应器秤谌, 能够得出最 终优化的基 础配方 小结:微生物菌种的开掘步骤 ? 微生物资源的全程开采大概要有:安排、收 集样品、涣散菌种、筛选、小试、中试、产 业化等阶段。 即 计划→采样→筛选(初选→复选→终选) → 实践室实践→中试→坐褥→资产化 69 ? 产 业 化 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ? ? ? ? ? ? ↓ ↓ ↓ ? ? ? ? ? ? ↓ ↓ ↓ ? 工 业 性 试 验 ( 验 证 、 修 改 、 优 化 技 术 经 济 指 标 ) 中 试 ( 菌 种 改 制 、 最 佳 工 艺 、 临 床 实 验 、 技 术 经 济 评 价 临 床 试 验 体 内 试 验 、 药 理 研 究 大 量 制 备 、 小 型 应 用 实 验 专 利 申 请 毒 性 体 外 试 验 化 目 艺小 学 的 道型 结 产 线试 构物 验 鉴制 定备 最 佳 培 专目 养 利的 条 申性 件 请状 、 、 生 活 物 性 学 的 特 测 性 定 研 究 、 菌 种 鉴 定 、 工 ) 高 产 高 活 性 产 生 菌 野 生 菌 复 筛 ( 目 的 产 物 或 性 状 的 复 核 、 产 生 菌 工 艺 性 状 的 考 察 ) 的初 测筛 定( 等产 生 菌 的 培 养 、 发 酵 、 模 型 设 计 、 目 的 产 物 或 性 状 分 离 富 集 、 预 处 理 、 抑 制 剂 、 培 养 基 设 计 、 培 养 条 件 采 样 环 境 因 素 、 天 然 及 人 工 基 质 、 微 生 物 代 谢 类 型 等 设 计 开 发 目 的 、 策 略 、 工 作 基 础 、 市 场 、 投 资 风 险 总 ( ) ( ) ( ( ( ( ) ( ( ( ) ) ) ) ) 私人的几点理解 ? 方针要昭彰:昭彰开掘方针并贯彻永远.是微生物 资源开采最根本、光阴不离的规定。 ? 立异为主题:新地方,新要领,新菌种,新模子, 新产品。主题是延续改善.变换开采的政策。 ? 模子是枢纽:修树确切、微量、神速、轻松的筛选 模子,尽早减少非方针菌株,加快筛选历程。 ? 思绪要大胆:敢为宇宙先 ? 要领要妥当:坚固的根本功 71

  第8章 微生物菌种的筛选及判断_生物学_自然科学_专业材料。第8章 食物微生物菌种的筛选及判断 主 讲 惠 明 博士 本节重心 ? 食物工业上规范的微生物菌种 ? 微生物菌种的涣散筛选及判断 ? 微生物菌种的发酵要求优化 一、规范工业微生物菌种 细菌